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蛋白酶K的前世、今生与未来

浏览次数:204      日期:2020-07-17 09:22:10

01前世


蛋白酶K(EC3.4.21.14)属丝氨酸蛋白酶类,1974年,Wolfgang Ebeling等利用沉淀、离子交换层析和凝聚层析等方法在林伯氏白色念球菌的培养基中分离纯化出蛋白酶K。因能合成该种蛋白酶的微生物能在以角蛋白(Keratin)为唯一碳氮源的环境中生长,即能够消化角蛋白,因此被命名为蛋白酶K。蛋白酶K由一条肽链组成,包含277个氨基酸残基,相对分子质量为28.9kDa。


蛋白酶K家族包含了各种由真菌、酵母及革兰氏阴性细菌分泌的细胞内肽酶。与其它的蛋白酶相比较,蛋白酶K具有高活力和高稳定性,其酶活不会被尿素、SDS和EDTA等变性剂抑制,且在高温、高盐或较高的pH等条件下,蛋白酶K仍能保持较高活性。因该酶在较广的pH范围(4~12.5)内及高温(50~70℃)均有活性,在提取DNA和RNA的缓冲液中具有很高的活性,可用于质粒或基因组DNA、RNA的分离,是DNA提取的关键试剂。


02今生


近年来,随着研究的深入,蛋白酶K的应用不仅仅局限在医疗诊断及科研领域。在实现规模化工业生产的前提下,蛋白酶K还可以替代作用范围较窄的其它蛋白酶,应用于工业制革、食品加工、饲料生产、造纸等行业中。另外,蛋白酶K也可以替代传统的可能存在污染的化学方法处理原材料,去除不必要的蛋白质杂质。


1、在新冠等传染病检测中的应用

对于新冠病毒,核酸扩增试验时的处理、抽提、扩增为高风险,因此扩增前需要对标本先行灭活病毒,蛋白酶K(Proteinase K)是病毒采样液的重要组分,可裂解病毒释放核酸,消除核酸分解酶(RNase)以防止病毒的RNA降解。并且可以灭活病毒,让病毒的蛋白变性,失去活性而“死掉”,不再有传染性,提高运输和检测阶段的安全性。


2、在DNA、RNA提取过程中的应用

蛋白酶K能降解与核酸结合的蛋白质,促进核酸的分离,在提取高分子量核酸时有很大的优势。蛋白酶K还常被用于RNA提取过程中RNase的抑制和降解。RNA的质量对于Northem印迹及杂交分析、cDNA合成及体外翻译等实验的成败至关重要。而RNA极不稳定、易于被广泛存在的RNase降解,因此利用蛋白酶创造一个无RNase的环境、严格防止RNase污染是成功提取RNA的关键。


3、在原位杂交中的应用

蛋白酶K在原位杂交技术中通常用于杂交前标本的处理,它具有消化包围靶DNA蛋白质的作用,以利于检测探针的穿透,提高检测的敏感性。


4、在皮革工业中的应用

皮革工业的脱毛和软化已大量利用蛋白酶,既节省时间,又改善劳动卫生条件。蛋白酶K可以有效降解角蛋白的特性,较大程度的破坏和剥离鳞片层,获得理想的羊毛防毡缩效果。而且蛋白酶K对羊毛作用集中在鳞片层,处理后对羊毛整体强力损伤较小,克服了普通蛋白酶的不足,防毡缩综合效果好。


5、在肉类嫩化中的应用

蛋白酶K能分解肉的肌纤维,结缔组织的蛋白质,甚至包括弹性蛋白及胶原蛋白,使蛋白质的各级空间结构发生变化,部分肽键断裂,肉料吸水膨胀,质地变嫩,满足消费者对肉类品质的要求。


6、在灭活生活和工业用水中细菌的应用

病毒外层结构一般以衣壳蛋白为主,衣壳蛋白保护病毒使其免受环境因素的影响并且决定病毒感染的特异性,蛋白酶K可以对病毒衣壳蛋白进行破坏(识别位点是大肠杆菌B脂多糖外膜中的二糖基残基),从而干扰病毒与宿主细胞的结合。用蛋白酶K进行病毒灭活的优点是消毒剂本身无害,而且不产生有害消毒产物,所以这是一种高效环保的方法。


03未来


蛋白酶K市场需求巨大


全球新冠肺炎感染人数不断创新高,近日世卫组织在新冠肺炎例行发布会上表示,实验研究发现新冠病毒D614G变异可能导致病毒加速复制和加强其传播性。据CNN报道,新版本病毒的传染性比此前版本高出3至9倍。新冠病毒传染性增强对疫情的防控无疑是产生更大的挑战,对新冠核酸检测的需求也不断提升,蛋白酶K作为核酸检测试剂盒中用于检测样本前处理的重要组分,目前市场需求也不断加大。


国产蛋白酶K替代进口将成必然趋势


蛋白酶K在体外诊断、药物加工等生物医药领域有着不可替代的重要作用。长期以来,我国实验室所用的蛋白酶K都是从各级代理商中买到的进口产品,下游产业严重依赖进口。随着新冠疫情的全球大流行,蛋白酶K供不应求,导致国内严重缺货,“卡脖子”效应明显。为了不受制于人,降低成本,国产蛋白酶K替代进口将成必然趋势。


体外诊断中国“芯”助力全球抗疫情


华美·科赛格自2015年就已开始从事蛋白酶K的研发、生产以及销售,疫情压力之下,华美·科赛格作为诊断试剂原料行业中的一员,助力全球抗疫情,大力推进研发并积极采购相关设备,进行蛋白酶K大规模的研发生产。经过不断的优化升级,我司现推出一批高质量的蛋白酶K(Proteinase K),利用本公司生化检测平台对自产蛋白酶K进行表征,显示其纯度高,比酶活高。该产品应用于新冠核酸提取试剂盒 ,能完全消化各种核酸酶和其他蛋白质,防止病毒核酸降解,优化提取效率 ,可满足新冠/HCV/HBV等检测需求。



■ 校准曲线

配制不同浓度的L-酪氨酸标准溶液,直接用紫外分光光度计于275nm测定其吸光度(A),以吸光度A为纵坐标,酪氨酸的浓度为横坐标,绘制校准曲线。根据校准曲线,计算出比酶活≥30 U/mg。



  

图1.以L-酪氨酸为标准品测定校准曲线


■ 纯度

通过SDS-PAGE电泳来检测蛋白浓度,本公司自产的蛋白酶K的纯度在95%以上,大小在28.9kDa。


图2.蛋白酶K的SDS-PAGE电泳图


■ 稳定性

将蛋白酶K粉末置于4℃存储一年,每隔1个月测酶活性,结果如下图,表明蛋白酶K稳定性好,酶活维持在95%以上。

图3.蛋白酶K在4℃下的稳定性检测