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肾功能及肾损伤标志物——中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)解析

浏览次数:215      日期:2018-11-20 10:20:14

中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)又称人脂质运载蛋白2(lipocalin2,Ln2)或噬铁蛋白(siderocalin),是人脂质运载蛋白家族中的一个新成员。近年来,NGAL作为一种新的肾损伤标志物倍受关注。


NGAL的合成及分布

NGAL由肾小管细胞、中性粒细胞等细胞类型合成,它标志性的存在于循环内,可被肾小球自由滤过,并被肾小管上皮细胞截获降解。

肾功能异常时,引起肾小管上皮细胞损伤,分泌大量的NGAL,大量NGAL通过诱导肾小管间质中浸润的中性粒细胞发生凋亡从而保护肾组织免受炎性细胞的损害,以此诱导肾小管上皮细胞再生。

NGAL在肾脏中的表达会因多种原因的肾损伤而显著升高,并且释放到尿液和血浆中。

正常情况下,NGAL在尿液和血浆中维持一个较低水平,而肾损伤时则在非常短的时间(2-4h左右)急速升高。


NGAL在AKI中的应用

NGAL用于AKI 的早期诊断

急性肾功能损伤( AKI) 时血、尿NGAL浓度会迅速升高,2h最为明显( 比临界值升高几十至几百倍),而血清肌酐( sCr) 、尿酶等传统指标往往要在24~72h后才明显升高,因而NGAL可用于AKI的早期诊断。

大量研究证明,肾脏在顺铂诱导的肾脏急性损伤后约2h 就能在尿中检测到NGAL,而检测出血肌酐明显改变要在等到3-4d后,同样在肾脏急性缺血再灌注损伤后3h在尿中也能检测到NGAL。儿童心脏手术后发生急性肾功能衰竭的患者在手术后2h血、尿NGAL的浓度明显升高,而血肌酐明显升高则要等到1~3d后。


NGAL可用于AKI的鉴别诊断

尿NGAL可鉴别AKI、肾前氨血症、慢性肾病和正常肾功能病人。


NGAL可用于AKI的危险分层

ICU诊断中NGAL能够预测急性肾损伤的严重程度;NGAL对不同程度的AKI诊断体现出高灵敏性和特异性。


NGAL可用于AKI临床结果的预测(发病率、死亡率等)

评估预后,NGAL 可作为AKI 的预后指标之一。体外循环术患者术后2、4、6 h 尿NGAL 水平与AKI 的持续时间、患者住院时间长短均显著相关,2h 尿NGAL 还与AKI 的严重程度( 是否需要透析治疗)及患者病死率明显相关。


NGAL在其他疾病中的临床应用

NGAL与肾移植

NGAL在肾移植中也可作为诊断标志物,使用NGAL、胱抑素C对肾移植患者预后的预测时发现:NGAL在肾移植前、后各时间点与肌酐、胱抑素C均具有正相关性,而与尿量呈负相关。移植肾功能延迟患者的NGAL、胱抑素C水平未见下降,提示NGAL可能作为预测移植肾功能延迟的早期预测指标,尤其对指导肾移植患者早期透析和抗排斥治疗具有重要价值。


NGAL与慢性肾损伤

CKD患者其尿NGAL水平显著高于健康者,患者GFR水平显著低于健康者,且尿NGAL与GFR具负相关。对尿NGAL、尿蛋白、尿微量清蛋白、GFR两两之间的相关性分析显示尿NGAL可作为CKD诊断的可靠指标。


NGAL与狼疮性肾炎

尿NGAL是预测狼疮性肾炎的敏感、特异指标。其预测狼疮性肾炎的敏感性和特异性高于ds-DNA。研究发现累及肾脏的系统性红斑狼疮患者,NGAL分泌量与血清肌酐和肌酐清除率正相关。但与SLE活动度评分指数无相关性,多元线性回归分析发现尿NGAL判断SLE患者肾脏损伤的特异性和敏感性高于ds-DNA。


NGAL与肿瘤

NGAL是一种分泌型急性反应时相蛋白。在乳腺癌、肺癌、胰腺癌等组织中上调表达。分化好的胰腺癌细胞高表达NGAL,而分化相对差的癌细胞极少表达NGAL。直肠癌组织直肠癌组织NGALmRNA过表达与肿瘤细胞浸润深度、淋巴结转移、静脉受累及肿瘤TNM分期相关。总之,NGAL在抑制肿瘤细胞黏附、转移、血管生成等方面具有应用价值。


NGAL与冠心病

SA、UA、NSTEMI、STEMI患者血清。NGAL水平与hs-CRP白细胞数显著正相关,提示血清NGAL可反映冠状动脉综合征患者的炎症水平。其血清NGAL具有较高的阴性预测值,并通过对炎症水平的反映而预测疾病的严重程度。


NGAL临床应用项目优势

1、监测时间早:NGAL可以在肾脏发生损伤2小时内就显著升高。血清肌酐、尿素氮需要1-3天才有明显升高;胱抑素C、微球蛋白需要在20小时左右有显著升高。

2、易于判断:NGAL提示值是正常样本含量的数百倍,这样可避免检验系统误差造成临界值不好判断的情况。

3、特异性高:在单一研究中心的均质患者人群中,NGAL是特异性最好的预测AKI的指标。


人NAGL单克隆抗体

科赛格最新推出的人NGAL单克隆抗体,通过化学发光和胶乳免疫比浊平台对NGAL单抗性能进行反复验证,并利用不同的抗体组合对多份临床样本进行检测,与一家高质量的比对试剂的结果具有高度一致性,证明NGAL单抗适用于化学发光和胶乳免疫比浊法试剂。


校准曲线

A. 化学发光平台

所有的单克隆抗体分别用作捕获抗体和标记抗体,组合成不同抗体对,用于双抗夹心法免疫检测。不同抗体对检测不同浓度的NGAL,进行四参数logistic拟合(图1),结果显示R²>0.99,配对组合理想。配对方式如下(捕获抗体-标记抗体):

MAb combination A: CSB-DA001DmN①-CSB-DA001AmN①

MAb combination B: CSB-DA001AmN①-CSB-DA001DmN①

MAb combination C: CSB-DA001AmN②-CSB-DA001DmN①

MAb combination D: CSB-DA001AmN③-CSB-DA001DmN①

▲图1. 不同NGAL抗体组合测NGAL的校准曲线


B. 胶乳比浊平台

将几种单抗混合包被于胶乳颗粒,制备成胶乳试剂,检测0∼5000 ng/mL的NGAL校准品,建立校准品浓度与反应吸光值的对应关系,进行线性回归拟合,如图2。

▲图2. 抗人NGAL单抗检测NGAL的校准曲线


临床比对

A. 化学发光平台

为验证抗体对适用于临床检测,利用抗体对组合(A、B、C和D组合)对50例临床样本进行检测,并与一家高质量的诊断试剂测值进行对比,检测结果如图3,此结果表明四种组合检测数据与比对试剂相关性较好。

▲图3. 不同NGAL抗体组合应用于化学发光平台对临床样本的检测


B. 胶乳比浊平台

为验证抗体是否适用于胶乳增强免疫比浊法,将本公司的自产抗体制成胶乳比浊试剂和一家高质量的诊断试剂同时对血清样本进行检测,两者相关性高达0.97(图4),说明本公司自产单抗适用于胶乳增强免疫比浊试剂。

▲图4. 自产抗体和比对试剂对血样的检测


热稳定性

将四种NGAL单克隆抗体置于-20℃、2-8℃和37℃,每隔3天测抗体的效价,从图5可以看出在2-8℃和37℃条件下抗体的滴度与-20℃条件维持在一定水平,说明该抗体稳定性好。 

▲图5. 四种NGAL单抗的稳定性测定


将NGAL单抗于4℃和37℃分别放置7天,再分别偶联至胶乳颗粒,然后在同一条件下检测不同浓度的NGAL校准品,结果如表1,37℃热处理的抗体相对于4℃存放,在检测性能方面变化很小,说明该抗体稳定性合格。

▲表1.不同温度处理后的单抗对NGAL检测的比较


人NGAL多克隆抗体

科赛格最新研发的人NGAL多克隆抗体,通过胶乳平台对NGAL多抗性能进行反复验证,采用自产的多抗应用于胶乳试剂和比对试剂同时检测多份随机样本,证明NGAL多抗可以用于体外诊断。


校准曲线

将NGAL兔多抗偶联至胶乳颗粒,检测0-4900 ng/ml蛋白,样本中的NGAL会与胶乳上的多抗反应,使胶乳颗粒凝集,从而提高溶液的浊度。根据NGAL浓度与吸光值的对应关系,拟合四参数Logistic曲线(图6)。

▲图6. 多抗胶乳试剂对不同浓度NGAL检测(胶乳增强免疫比浊法)


临床比对

利用外购高质量的比对试剂和本公司多抗制成胶乳试剂对50份随机样本进行检测,结果如下图7,两者相关系数高达0.98,表明本公司自产的多克隆抗体可以用于临床检测试剂中。

▲图7.自产多抗配制试剂与外购比对试剂对临床样本测值的比较(胶乳增强免疫比浊法)


稳定性

将多抗(未加保护剂)置于37℃加热处理7天后,然后偶联至胶乳颗粒,制备成胶乳试剂,检测不同浓度下的NGAL校准品,与未加热处理组比较(表2)。结果显示两者偏差不大,说明多抗比较稳定。

▲表2. 不同温度处理后的多抗对NGAL检测的比较


NGAL蛋白

科赛格同时还提供高质量的人NGAL蛋白,货号为CSB-DP001A 。该蛋白以液体形式供应,用SDS-PAGE检测蛋白纯度在95%以上,可以用于免疫测试的校准品、免疫印迹(WB)等方面。


参考文献

1. Mishra J,Dent C,Tarabishi R,et al.Neutrophil gelatinase-associatedlipocalin(NGAL)as a biomarker for acute renal injury after cardiacsurgery[J].Lancet,2005,365( 9466):1231-1238.

2. Bolignano D,Lacquaniti A,Coppolino G,et al.Neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL)and progression of chronic kidney disease[J].Clin J Am Soc Nephrol,2009,4(2) :337-344.

3. 许文燊.中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白——一种新的肾损伤标志物[J].临床检验杂志,2011,29(4):285-287.

4. 蔡彦, 梅长林. 中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白临床应用研究进展[J]. 中华内科杂志, 2012,51(8):660-662.


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